RGEN-ISL: Neue CRISPR/Cas9 basierte “zytogenetische Taschenlampe”

08.03.2019

Im Gegensatz zur herkömmlichen in-situ Hybridisierung wird die DNA bei der Benutzung der neu beschriebenen RNA-guided endonuclease - in situ labelling-Werkzeugs (RGEN-ISL) nicht denaturiert. Folglich bleibt das Chromatin unbeschädigt und somit kann nun auch die Chromatinstruktur untersucht werden. Des Weiteren ist RGEN-ISL mit Protein-Nachweismethoden kombinierbar und ermöglicht die Echtzeitvisualisierung des Markierungsprozesses. Ursprünglich wurde die neue Methode für Pflanzengenome entwickelt, jedoch kann RGEN-ISL vermutlich in allen Organismen verwendet werden und stellt ein vielversprechendes, neues Werkzeug im Gebiet der Chromosomenbiologie, einschließlich der Medizin, dar.

Während die scherenartigen Eigen-schaften des bakteriologischen Immunsystems bereits in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, verwenden Forscher des Leibniz-Instituts IPK Gatersleben CRISPR/Cas9 nun, um Licht in das eukaryotische Genom zu bringen – mit der neuen molekularen Visualisierungsmethode RGEN-ISL (RNA-guided endonuclease - in situ labelling).

In den letzten 30 Jahren war Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) die etablierte und übliche Methode, um in-situ DNA-Sequenzen auf chromosomaler Ebene zu visualisieren. Jedoch setzt die Anwendung von FISH die Denaturierung der zu untersuchenden DNA voraus, was oft zur Schädigung der Chromatinstruktur führt. Indem die IPK-Forscher die RGEN-ISL-Methode auf CRISPR/Cas9 basierten, konnten sie nun den Denaturierungsschritt umgehen. Zugleich konnten sie die gewünschten Fluoreszenzmarkierungs-eigenschaften der konventionellen FISH-Methode in ihre neue zytogenetische Methode integrieren. Da die Anwendung von RGEN-ISL die Chromatinstruktur schont, ermöglicht sie nun auch die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Struktur des Genoms.

Weitere Experimente zeigten, dass RGEN-ISL die Leistungen herkömmlicher Methodenkombinationen, beispielsweise von FISH und Immunhistochemie, übertrifft. So ist die benötigte Vorbereitung geringer und die neue Methode zudem vergleichsweise schneller und günstiger. Wichtig ist, dass RGEN-ISL bei einer Temperaturspanne von 4 °C bis 37 °C funktioniert und mit zusätzlichen Proteindetektions- und bildgebenden Methoden kombiniert werden kann. Ein weiterer Bonus ist, dass RGEN-ISL die Echtzeitvisualisierung des CRISPR/Cas9-basierten DNA-Markierungsprozesses ermöglicht und somit die Kinetik der Reaktion mit aufzeigt.

Bisher haben die Forscher RGEN-ISL an pflanzlichen und  menschlichen Chromosomen getestet und damit aufgezeigt, dass ihre Methode wahrscheinlich in allen Organismen angewendet werden kann. Derzeit ist die Verwendung von RGEN-ISL auf repetitive DNA-Sequenzen beschränkt, welche beispielsweise oft in Pflanzen gefunden werden. Jedoch glauben die Forscher dass RGEN-ISL zukünftig auch für die Visualisierung von Einzelkopie-Sequenzen adaptiert werden kann.

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30847946