Neues effizientes Klonierungsverfahren ZeBRa

13.03.2019

Allen Verfahren, die derzeit zur Klonierung eingesetzt werden, ist gemeinsam, dass DNA-Fragmente zunächst in größere Trägermoleküle, sog. Vektoren, eingebaut werden. Die mit DNA-Fragmenten beladenen Vektoren werden anschließend in Bakterien eingeschleust. Indem sich die Bakterien vermehren und so eine Bakterienkolonie bilden, werden die DNA-Fragmente tausendfach vervielfältigt. Bisher haben diese Verfahren einen wesentlichen Nachteil: Weil der Einbau von DNA-Fragmenten in das Trägermolekül nicht immer störungsfrei und mit der nötigen Perfektion gelingt, besitzen keineswegs alle, sondern nur einige Kolonien die Vektoren mit den zu vervielfältigenden DNA-Fragmenten. Um diese „Erfolgsfälle“ zu identifizieren, war bisher ein zeitaufwändiges und teures Screening unvermeidlich.

Bayreuther Forschern ist es jetzt gelungen, dieses Screening überflüssig zu machen. Bei dem von ihnen verwendeten Vektor handelt es sich um ein Plasmid, das in seiner Ringstruktur ein toxisches Gen enthält. DNA-Fragmente werden nun so in das Plasmid eingebaut, dass sie dieses Gen ersetzen. Gelingt dies nicht, bleibt das toxische Potenzial im Plasmid erhalten. Wird in einem solchen Fall das Plasmid in ein E. coli-Bakterium eingeschleust, setzt die toxische Wirkung ein: Sie führt dazu, dass das Bakterium vermehrungsunfähig wird und nicht lange überlebt. Dadurch ist von vornherein gewährleistet, dass nur solche E. coli-Bakterien Kolonien bilden, in denen die DNA-Fragmente tatsächlich enthalten sind. Sie müssen nicht mehr nachträglich mühevoll ausgelesen werden. Die Auslese der erfolgreich mit klonierten DNA-Fragmenten ausgestatteten Bakterien erfolgt also durch die Plasmide selbst. Die vervielfältigten Plasmide können dann wie gewohnt aus diesen Bakterien isoliert und weiterverwendet.

Das jüngst publizierte Verfahren vereinfacht den Vorgang der Klonierung aber noch in einer weiteren Hinsicht: Die Wissenschaftler haben eine aus den Zellen von E. coli-Bakterien gewonnenen Extrakt (SLiCE) so optimiert, dass er sich hervorragend als „Klebstoff“ eignet, um mehrere DNA-Fragmente wie die Glieder einer Kette aneinanderzureihen und zu verbinden. So können jetzt verschiedenste Kombinationen von DNA-Fragmenten in das Plasmid eingefügt werden – und zwar deutlich schneller als mit bisherigen Methoden.

Das Akronym ZeBRa leitet sich von den wissenschaftlichen Bezeichnungen zweier Faktoren ab, die dabei entscheidend sind. Das verwendete Plasmid ist ein „Zero-Background Vector“. Dies bedeutet: Bakterien, die Plasmid-Moleküle ohne die zu vervielfältigenden DNA-Fragmente enthalten, bilden keine störenden Kolonien im Hintergrund. „Reda-Exonuclease“ ist wiederum ein Bestandteil des E. coli-Extracts, mit dem verschiedene DNA-Fragmente aneinandergekettet und in den Vektor eingebaut werden können.

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30814590